《自然-生物技術》同期發表兩項單細胞測序“黑科技”:細胞分型、細胞起源等領域迎來突破

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樓主 2020-06-04 06:02:50
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單細胞測序研究一直是近年來的熱門話題。2013年,《科學》將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首,可見此項技術的重要性。如今,單細胞測序技術在腫瘤、發育生物學、微生物學、神經科學等領域發揮這重要作用,為科學家提供了更為精準的決策依據,為個性化預防、治療提供了技術支持,正成為生命科學研究的焦點。昨日,Nature Biotechnology期刊同期發表了兩項單細胞測序的“黑科技”,為該技術的發展帶來了新的突破。

在第一篇文章中,來自俄勒岡健康與科學大學(OHSU)的研究團隊首次開發出一種高度可擴展的單細胞全基因組甲基化分析方法,能夠高效且快速識別人體內細胞亞型。相關研究成果于4月10日發表在Nature Biotechnology期刊,論文題為“Highly scalable generation of DNA methylation profiles in single cells”。

對于每個機體而言,所有細胞都攜帶著相同的基因組,在特定的細胞中,基因表達的模式可以幫助我們區分不同細胞。即便如此,相似的細胞之間仍然有著細微的差異。2017年,科學家發現可以通過DNA的甲基化模式,即甲基化組,來鑒別神經元的亞型。

在sci-MET技術中,研究人員為每個細胞添加一種能夠被測序儀讀取的特異性DNA標簽,能同時分析大量單細胞的甲基化組信息。研究人員在多個人類細胞系和小鼠腦細胞中驗證了這種新技術,獲得了3,282個單細胞重亞硫酸氫鹽測序(scBS-seq)文庫,揭示了單細胞的甲基化組信息,該數字是現有單細胞測序方法通量的40倍,并實現了68±8%的reads回貼率(alignment rates)。利用sci-MET技術,研究人員對三種人類細胞系混合物的細胞特征進行了鑒別,并從小鼠皮層組織中成功鑒定出興奮性和抑制性神經元。

該項目的領導者、OHSU醫學院分子與醫學遺傳學助理教授Andrew Adey介紹:“我們可以同時對數千個細胞進行分析。這項技術將制備單細胞DNA甲基化文庫的成本從每個細胞20~50美元降低到50美分以下。”他還表示:“在任何存在細胞類型異質性的環境下,該技術都是非常有價值的。我們關注的領域主要是癌癥和神經科學,但是我們同樣可以將該技術應用到心血管疾研究中。”

研究團隊展望,該技術能夠進一步提升人們在分子水平上對疾病的理解,最終促進癌癥、大腦神經元損傷疾病以及心血管疾病等領域精準醫學的發展。

在另一篇文章中,來自德國馬克斯·德爾布呂克分子醫學中心的研究團隊開發出一種名為“LINNAEUS”的技術,能夠在數千個單個細胞中同時進行譜系追蹤和轉錄組分析,提供了一種系統的方法來追蹤新型細胞的起源或在不同條件下對已知的細胞類型進行鑒定。相關研究成果于4月10日發表在Nature Biotechnology期刊,論文題為“Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR–Cas9-induced genetic scars”。

發育生物學的一個關鍵目標是了解單細胞如何轉化為包含許多不同細胞類型的完全生長的生物體。如今,單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術通常用于鑒定組織或器官中的細胞類型,但將細胞類型的分類結果轉化為譜系樹并了解細胞的發育起源仍然具有挑戰性。

來自德國馬克斯·德爾布呂克分子醫學中心的Jan Philipp Junker博士為該論文的通訊作者,他說道:“當我們利用單細胞RNA測序這類技術研究某個器官或生物時,我們會發現相似的細胞類型,同時也會發現未知的或者罕見的細胞。那么問題隨之而來:這些差異類型源自何處?”研究人員表示,基因在胚胎發育過程中發生突變或受環境影響發生損傷后,每個細胞系中都會記錄損傷的程度和修復機制,即使成年斑馬魚的心臟在損傷后再生也是如此。

LINNAEUS的技術原理正是這些DNA中的“疤痕”,其作用類似于一個條形碼,研究人員正是利用這些“疤痕”識別細胞來源。研究人員將scRNA-seq與譜系條形碼的計算分析相結合,并借助先進的CRISPR-Cas9基因組編輯技術,重構了斑馬魚幼體以及成年斑馬魚心臟、肝臟、胰腺和端腦的發育譜系樹。具體而言,研究人員對處于單細胞階段斑馬魚胚胎細胞注射了CRISPR-Cas9系統。在接下來的8小時中,Cas9多次切割了斑馬魚基因組中絕對不需要的序列:紅色熒光蛋白基因(RFP)。隨著胚胎細胞的紅色光暈逐漸消失,DNA的“傷口”處則出現了數千個“疤痕”。

Junker博士說道:“CRISPR通常會在一個精準位點進行切割,但是細胞在下一次細胞分裂前只有不足15分鐘進行修復。修補必須快速進行,因此染色體片段都是黏附在一起的,這也是錯誤發生的地方。DNA上的疤痕長短不一,而且它們的精確位置也是各不相同。”而子細胞在細胞分裂過程中會遺傳這些“基因疤痕”,研究人員則可以此識別那些來源于共同祖先的細胞。

雖然單細胞RNA測序能夠通過細胞類型映射數千個細胞,但是“基因疤痕”可以展現出細胞間上百萬個關聯,這使得研究人員能夠成功構建譜系樹,進而了解細胞的發育起源。目前,Junker的實驗室仍在繼續使用斑馬魚作為模式生物,但研究團隊還發現了將這種技術應用到人類細胞器中的潛能,這可能最終幫助我們理解患者體內的哪些突變會對細胞譜系造成永久損傷,進而更好對抗疾病。

參考文獻:

1.?Bastiaan Spanjaard et al (2018): "Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR-Cas9-induced genetic scars",?Nature Biotechnology. Advance Online Publication 09.04.2018, doi:10.1038/nbt.4124.

2.?Ryan M Mulqueen, Dmitry Pokholok, Steven J Norberg, Kristof A Torkenczy, Andrew J Fields, Duanchen Sun, John R Sinnamon, Jay Shendure, Cole Trapnell, Brian J O'Roak, Zheng Xia, Frank J Steemers, Andrew C Adey, "Highly scalable generation of DNA methylation profiles in singles cells,"?Nature Biotechnology, April 9, 2018, DOI: 10.1038/nbt.4112

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